lc3模拟器

lc3模拟器

大家好，今天我想和大家详细讲解一下关于“lc3模拟器”的知识。为了让大家更好地理解这个问题，我将相关资料进行了分类，现在就让我们一起来学习吧。

文章目录列表:

1.lc3?????

2.自噬专题---待续

3.细胞自噬研究策略

4.（2014?武昌区模拟）如图所示的直角三角形ABC是玻璃砖的横截面，∠B=90°，∠A=30°E为BC边的中点，BC=三

5.梦幻模拟战1问答_属性

6.一切为了省钱！这四款SUV百公里不到7升油

lc3?????

你总要说个是什么作用的电子电路图啊。不然谁知道你要的是什么啊！？

我把电路图发给你的邮箱里去还是贴在这儿好呢？

双音电子门铃电路（一）

本例介绍一款双音电子门铃，它能根据按动按钮的时间长短的不同而发出两种声音。当短促地按动门铃按钮时，门铃发出鸟叫声；若较长时间（大于1. 5s）按动门铃按钮时，则门铃发出“叮咚”声。主人可根据门铃声的不同而区分是家人还是客人。

电路工作原理：

该双音电子门铃电路由输入触发电路和音效输出电路组成。

电路中，输入触发电路由门铃按钮S、晶体管V1、电阻器R1一R3、电容器C1和双D触发器集成电路ICI (A1、A2)组成；音效输出电路由音效集成电路IC2、电容器C2、电阻器R4、R5、晶体管V2和扬声器BL组成。

按下按钮S后，ICI的D2端变为低电平，同时VI截止，IC1的CPI端电位升高，触发器A1受触发翻转，在IC 1的《介2端产生一个低电平触发脉冲信号。

若短促地按动一下S，则松开S后IC 1的D2端即由低电平恢复为高电平，在CP2端未加人触发脉冲信号之前，触发器A2就已输出触发脉冲至IC2的TRIG1端，使IC2受触发而输出鸟叫声电信号。该信号经V2放大后，驱动扬声器BL发出鸟叫声。

若较长时间按下S（超过1.5s），则IC 1的D2端一直保持低电平，触发器A2因CP2端加人触发脉冲信号而翻转，为IC2的TRIG2端提供触发脉冲，此时BL发出“叮咚”声。

元器件选择

Rl一R5选用1/4W或1/8 W碳膜电阻器。

C1和C2均选用耐压值为lOV的铝电解电容器。

V1选用S9014或3 DG12型硅NPN晶体管：T2选用59013或58050型硅NPN晶体管。

IC1选用C D4013型双D触发器集成电路；IC2选用KD一巧6型音效集成电路。

BL选用8Ω、0. 25W的小型电动式扬声器。

GB使用2节5号电池。

双音电子门铃电路（二）

本例介绍一款能发出两种门铃声的双音电子门铃，其特点是:当来客持续按压门铃按钮超过2s时，门铃发出带有余音效果的"叮咚"声;若连续点压门铃按钮超过3次，则门铃会发出悦耳的鸟鸣声。

电路工作原理

该双音电子门铃电路由触发控制电路和门铃声发生电路组成，如上图所示。

触发控制电路由门铃按钮S、电阻器Rl-R3、电穿器Cl-C3、二极管VDl-VD3、六非门集成电路ICl(Dl-D6)和电子开关集成电路lC3(S1、S2)组成。

门铃声发生电路由电阻器R4-R6、音效集成电路lC2、屯容器C4、晶体管V和扬声器BL组成。

当持续按压门铃按钮S超过2s时广ICl内部D4将输出高电平，该高电平经R2对C2充电，当C2充电至1.5V时，D5输出低电平，D6输出高电平，使IC3内部的电子开关Sl导通，IC2受触发而工作，其2脚输出的音效电信号经V放大后，驱动BL发出"叮咚"声。

当连续点按门铃超过3次时，ICl内部的Dl将输出高电平脉冲，该高电平脉冲经VD2整流后对C3充电，便D2输出低电平，D3输出高电平，使IC3内S2接通，IC2受触发工作，其2脚输出的音效电信号经V放大后，驱动BL发出悦耳的鸟鸣声。

元器件选择

Rl-R6选用1/4W金属膜电阻器或碳膜电阻器。

Cl-C4均选用耐压值大于6V的铝电解电容器。

_Dl-VD3均选用1N4148型硅开关二极管。

_选用S9013或C8050、3DGl2型硅整流二极管。

ICl选用CD4069型六非门集成电路;IC2选用KD-156型音效集成电路;lC3选用CD4046型模拟开关集成电路。

感应式电子门铃电路（一）

本例介绍一款感应式电子门铃，它在有客人来到门前时，能发出优美的音乐声。将该门铃的感应电极片放在仓库等处的门窗上，还可作为防盗报警器使用。

电路工作原理

该感应式电子门铃电路由感应式电子开关和音乐发生器电路组成。

电路中，感应式电子开关电路由感应电极片A、晶体管V1一V4和电阻器R1、电位器RP组成；音乐发生器电路由音乐集成电路IC、电阻器R2、晶体管V5和扬声器BL组成。

接通电源开关后，该感应式电子开关电路进人待机状态。当有人靠近感应电极片A时，人体感应信号经V1一V3三级直接放大后，使V4导通，IC通电工作，其输出的音乐电信号经V5放大后，驱动扬声器BL发出音乐声。

调整RP的阻值，可以改变感应式电子开关电路动作的灵敏度。

元器件选择

R1和R2选用1/4W碳膜电阻器或金属膜电阻器。

RP选用膜式可变电阻器。

V1一V3选用3 DG6或S9013型硅NPN晶体管；V4和V5选用C8050或S8050、3 DG8050、3DG12型硅NPN晶体管。

IC选用KD9300或CW9300型音乐集成电路。

BL选用0. 25 -0.5W、8Ω的电动式扬声器。

GB选用三节5号电池。

S选用小型单极拨动式开关。

A使用25 -40cm，的薄金属片制作。

三音电子门铃电路（二）

本例介绍一款采用数字电路制作的三音电子门铃，它可以通过对按钮的设置，使输出的声音有所不同，从而达到区别来客身份的目的。

电路工作原理如下图所示：

该三音电子门铃电路由编码触发电路、多音发生器和音_放大电路组成。

电路中，编码触发电路由按钮S1一S6,四输人二与门（Pl、D2)集成电路IC1、电阻器R1一R11和晶体管V1一V3等组成；多音发生器电路由模拟火车声的集成电路IC2、发光二极管VLl与V L2和电阻器R13 - R巧组成；音_放大电路由音_放大管V4和扬声器BL组成。C为电源滤波电容器，GB为电池。

在未按动按钮S1一S6时，V1一V3均截止，IC2不工作，扬声器BL中无声音，门铃处于静止状态。

当按动S6时，V1因基极输人高电平而导通，在IC2的TRI输人端上产生低电平触发脉冲，使IC2受触发而工作，从其0/P端输出音_信号，该信号经V4放大后，通过扬声器BL发出火车起动的“呕当”声。

当同时按动S4和S5时，IC1内与门电路D1的四个输人端均为高电平，其输出端也输出高电平脉冲，使V2导通，在IC2的TR2输人端上产生低电平触发脉冲，IC2受触发而工作后，从0/P端输出复合音_信号，该信号经V4放大后，驱动扬声器BL发出道口铃声＋火车起动的“呕当”声。

当同时按动S1一S3时，IC 1内与门电路D2的四个输人端均变为高电平，其输出端也变为高电平，使V3导通，在IC2的TR4输人端产生低电平触发脉冲，ICZ受触发工作后，从 0/P端输出复合音_信号，该信号经V4放大后，驱动扬声器BL发出“汽笛声＋行驶声＋铃声＋呕当”的组合声音。在扬声器BL发出火车声的同时，发光二极管VL1和VL2同步闪亮。

自家人按门铃时，可同时按动S1一S3。亲朋好友按门铃时，可以告诉他们“秘密”，让他们同时按下S4和S5。生客按门铃是随意的，通常只按动某一按钮，该门铃在按动S1一S5中任一按钮时均无反应，只有按动S6时，门铃才发声，因此主人很容易判断出来客是生人。

元器件选择

R1一R15选用1/4W或1/8W碳膜电阻器。

C选用耐压值大于6V的铝电解电容器。

VLI和VL2均选用币3mm高亮度发光二极管。

V1一V3均选用59013型硅NPN型晶体管；V4选用C8050型硅NPN型晶体管。

IC1选用CD4082型四输人二与门集成电路，IC2选用KD56024型集成电路。

BL选用0. 25W、80微型电动式扬声器。

S1一S6均选用常开型按钮。使用时可将S6安装在_显眼的部位，与S1－S5分开。

自噬专题---待续

基础知识-研究方法-案例

1.基础知识：

分类： 非选择性自噬 -大自噬、小自噬、分子伴侣介导的自噬；

选择性自噬 -线粒体自噬 (mitophagy)、聚集体自噬 (aggrephagy) 等选择性自噬；

一、 大自噬形成过程 ：3步：内质网和高尔基体等形成环状结构，包裹胞内结构形成双层膜囊泡结构， 即自噬体 ；然后自噬体与溶酶体融合；自噬体内蛋白或者细胞器在溶酶体内被溶酶体酶讲解。（ 三类标志物 ：囊泡形成过程的标志物、溶酶体标志物、自噬底物标志物）

? 囊泡形成过程的标志物:? （1） Atg12-Atg5复合物---WB检测： Atg12--15 kDa；Atg5--32 kD；复合体--55 kDa ；（2）Atg16L1--Atg12-Atg5- Atg16L1复合物，不过自噬体形成后就离开了； 检测早期自噬体的形成-方法： 进行免疫透射电镜和免疫染色的检测；（3） LC3 参与了自噬体膜的形成，包括相互转化的形式即LC3-I和LC3-II（细胞内新合成的LC3经过加工, 成为胞浆可溶形式的LC3-I, 后者经泛素化加工修饰, 与自噬体膜表面的PE结合, 成为膜结合形式的LC3-II。LC3-II定位于前自噬体和自噬体, 是 自噬体的标志分子 , 随自噬体膜的增多而增加）；检测方法--WB ： ?LC3-I 18 kDa, LC3-II 16 kDa ；（尽管PE偶联形式的LC3-II的分子质量较LC3-I大, 但是其具有强疏水性, 因此在SDS-PAGE中电泳迁移率反而比LC3-I (非PE偶联的LC3) 快，可以通过Western blot比较组间LC3-II水平, 也可通过计算 LC3-II/LC3-I的比值来评价LC3-II水平 , 并推测自噬囊泡数量的多少。） 注意：LC3在含SDS的样品裂解液中易降解, 因此样品经煮沸裂解后应当尽快进行Western blot实验,并避免反复冻融。? （4）Atg9/mAtg9 --Atg蛋白中_的跨膜蛋白；哺乳动物细胞的为mAtg9，在形成成熟自噬体后, mAtg9 并未整合进自噬体囊泡上, 而是又游离进入胞浆；用来检测为自噬的发生；（5） Atg6/Beclin1： 用荧光显微镜或透射电镜可检测Beclin1-GFP的点状聚集或斑块作为自噬标志物 ? ?溶酶体标志物： 一般为溶酶体膜蛋白：溶酶体相关膜蛋白1 (lysosome-associated membrane protein type 1, LAMP- 1)、LAMP-2和溶酶体整合膜蛋白 (lysosomal integral membrane protein, LIMP-2)--检测方法：可用免疫组化或Western blot的方法检测溶酶体重要膜蛋白的水平, 并与其他自噬相关蛋白结合使用。 ? ?自噬底物标志物： p62也被称为SQSTM1, 在多种细胞和组织中 都有表达, 可作为一个货车蛋白参与多种信号转导过程。p62可连接LC3和泛素化的底物, 随后被整合到自噬体中, 并在自噬溶酶体中被降解； 当自噬被激活时自噬体与溶酶体融合, 自噬囊泡中p62等蛋 白或细胞器被溶酶体酶降解 , p62水平降低 ; 当 自噬被抑制 时自噬体积累 , p62水平升高 。因此, 可以用Western blot方法检测p62的水平, 作为自噬能力变化的指征。

二、CMA的标志物： CMA是胞浆内某些蛋白质被分子伴侣如热休克蛋白质70 (heat shock cognate protein of 70 kDa, HSC70) 识别, 并将其运送到溶酶体膜上, 再经溶酶体膜蛋白LAMP-2a结合后被转运到溶酶体腔中被溶酶体酶消化的过程，与大自噬和小自噬相比, CMA的主要特点是细胞质内的蛋白质直接经溶酶体膜蛋白转运入溶酶体腔, 不需形成自噬囊泡。（1）HSC70 ?70 kDa的热休克同源蛋白, 它是分子伴侣, 在胞浆识别带有KFERQ样序列的CMA底物；（2）?LAMP-2a ?CMA的速率直接依赖于溶酶体膜上LAMP-2a的含量，LAMP-2a在胞内的水平可由于转录水平改变或降解速率改变而发生变化。抑制LAMP-2a将引起CMA底物GAPDH的聚集; 过表达LAMP-2a, 则引起GAPDH水平下降。

三、 线粒体自噬标志物

?线粒体自噬指在ROS、营养缺乏和细胞衰老等内外环境的刺激下, 细胞内的线粒体发生去极化, 而这些被损伤的线粒体将被特异性地包裹进自噬体中并与溶酶体融合, 从而完成 损伤线粒体的降解, 维持细胞内环境稳定 的过程。

?流程：损伤的线粒体在发生线粒体自噬之前先发生动力相关蛋白1 (dynamin-related protein 1, DRP1) 介导的 线粒体分裂。线粒体膜电位的下降引起PTEN诱导假定激酶 (phosphatase and tensin homolog-induced putative kinase 1, PINK1) 的聚集, 接着招募E3泛素连接酶Parkin到线粒体。Parkin促进线粒体膜上蛋白质泛素化, p62蛋白与线粒体上泛素化蛋白相互作用, 借助p62与LC3的互作引导线粒体被自噬体包裹[ 24 ]。同时, 线粒体上存在自噬受体如BNIP3 (Bcl-2 and adenovirus E1B 19-kD interacting protein 3) 和NIX/ BNIP3L (BNIP3-like) 也可以与LC3互作使得受损线粒体通过自噬方式被去除。 通常用 线粒体标志物和 自噬标志物 LC3 共定位来显示线粒体自噬。此外, 还有几个线粒体自噬受体也可以考虑用作线粒体自噬的标志。

?（1）Atg32是一个分子质量约59 kDa的跨膜蛋白, 定位_粒体外膜上；

（2）BNIP3和NIX ?BNIP3和NIX序列上有56% 的同源度, 且都有BH3结构域, 并与Bcl-2作用。

分子标记：如下图 ? （ATG5，LC3）

LC3：?Atg8/微管相关蛋白1轻链3 (microtubule- associated protein1 light chain 3, LC3)

reference：/YXXB/html/20160106.htm?

2.研究方法：一般都是WB

3.研究案例：

本文就从_近师兄推给我的一篇文章，一起学习一下吧。

总结一下：本文思路蛮清晰的简单的，动物与细胞表型；通路的探讨；直接作用的证明。其中，直接作用的证明用了模拟方式，没有通过实验。

这样就会想到：验证直接相互作用的方法：蛋白之间-蛋白DNA之间-蛋白RNA之间 相互作用，不管是酵母双杂交、CO-IP、pulldown、ChIP

细胞自噬研究策略

医学科研实验基础知识笔记（四）：细胞自噬研究策略

细胞自噬是指细胞在外界环境因素的影响下， 细胞利用溶酶体降解自身受损、 变性或衰老的大分子物质以及细胞器的自我消化过程。自噬是细胞的一种自我保护机制， 广泛存在于真核细胞内， 在调节细胞生存和死亡的过程中， 起着重要的作用。

当细胞发生自噬后， 在自噬相关基因的调节下， 细胞通过单层或双层膜， 包裹待降解的细胞质或细胞器， 形成囊泡状的自噬体（autophagosome） 。然后自噬体再和溶酶体（lysosome）

发生融合形成自噬溶酶体（autolysosome） ， 由溶酶体内的一系列水解酶， 降解自噬溶酶体内所包裹的内容物， 以实现细胞对自身代谢和能量的更新。

1.自噬的细胞学分类及过程

根据细胞内物质运输到溶酶体的方式以及生理功能的差异， 哺乳动物的细胞自噬可以分为三种类型：大自噬/宏自噬（macroautophagy） ， 小自噬/微自噬（microautophagy） 和分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediated autophagy， CMA） 。

1） 大自噬/宏自噬：我们通常所说的自噬指的就是大自噬/宏自噬。在大自噬的过程中， 细胞质中可溶性的大分子物质以及变性的细胞器， 被内质网、 线粒体来源的单层或双层膜包裹形成自噬体。接着自噬体的外膜与溶酶体膜融合， 进一步形成自噬溶酶体， 自噬体内的待降解物被一系列的水解酶降解， _终完成整个的自噬过程。

2） 小自噬/微自噬：与大自噬过程不同， 是溶酶体膜自身发生内陷， 包裹和吞噬细胞内待降解的底物， 并在溶酶体内发生降解。小自噬与大自噬的区别就在于， 在小自噬过程中胞质成份是直接被溶酶体包裹， 没有形成自噬体的过程。

3） 分子伴侣介导的自噬：在分子伴侣介导发生的自噬过程中， 其待降解的底物都是可溶性的蛋白质分子。分子伴侣蛋白识别带有特定氨基酸序列的底物蛋白质分子， 并与之结合， 然后再经溶酶体膜上的受体 Lamp2a（lysosome-associated membrane protein 2， Lamp2） 转运到溶酶体；底物蛋白分子再在溶酶体内， 被水解酶降解。因此， 分子伴侣介导的自噬与前两者不同， 在降解蛋白时具有选择性。而大自噬和小自噬现象中， 一般而言， 在降解蛋白时没有明显的选择性。

2.自噬信号通路

3.自噬与凋亡的关系

细胞凋亡也被称为 I 型程序性细胞死亡；自噬则被称为 II 型程序性细胞死亡。凋亡和自噬是两种显著不同的细胞死亡形式， 两者在形态、 生化指标以及调控细胞死亡的过程上都存在着较大的差异， 但两者又不是两个完全独立的过程。许多研究表明， 凋亡和自噬的作用以及功能在某些情况下也是相互影响和制约的。自噬和凋亡之间存在着三种不同类型的相互作用，而且每种类型都对应着相应的特定的细胞类型、 刺激和环境。

1） 自噬和凋亡互相协同， 共同促进细胞死亡。两种效应之间， 可以其中一种效应影响另一种效应；自噬也可以作为凋亡的上游调节因子， 直接调控细胞凋亡， 从而影响细胞的死亡；

2） 自噬可以通过促进细胞存活而拮抗细胞的凋亡效应。比如， 可以通过去除因氧化应激受损的细胞器， 或降解变性的大分子物质， 为饥饿的细胞提供生存所需要的营养和能量；或者通过降解未折叠的蛋白来抑制内质网应激。自噬的这些功能将会抑制促凋亡信号的产生， 从而起到拮抗细胞凋亡的作用。

3） 自噬有时虽然自身并没有导致细胞死亡， 但却参与了细胞凋亡的过程。比如自噬参与了一些 ATP 依赖的凋亡过程。

4.自噬的分子机制和特征

1） 自噬诱导阶段（induction） ：正常生理状态下， 细胞保持很低的基础自噬水平。这时细胞内能量充足，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物 1(也就是 mTOR 复合物 1，也叫做 mTORC1)处于活化的状态。活化的 mTORC1 通过磷酸化的方式使得 ATG13 发生磷酸化反应， 从而抑制细胞的自噬。

2） 成核过程（vesicle nucleation） ：成核过程和_ps34-ATG6 复合物密切相关。这个复合物还包含有调节性蛋白激酶_ps15， 共同作用于膜泡的成核， 介导 PAS(也就是前自噬体结构pre-autophagosomal structure)的形成。

_ps34-ATG6 复合体还可以召集 ATG12-ATG5 和 ATG16 多聚体以及 LC3， 并通过后两者促进吞噬泡的伸展扩张。请大家注意，_ps34 在哺乳动物中的同源蛋白是 class III PI3K；ATG6在哺乳动物中的同源蛋白是 Beclin-1， 所以_ps34-ATG6 复合体， 也被称为 PI3K-Beclin-1复合物。

3） 自噬体的延伸阶段：这个过程的分子机制是_为复杂的。哺乳动物自噬体的延伸主要依赖于两个类泛素化的系统：a） ATG12 的结合过程；b） LC3 的修饰过程。

ATG12 的结合过程是类似泛素化的过程， 需泛素活化酶 E1 和 E2 的参与。ATG12 首先由 E1样酶 ATG7 活化， 再通过 E2 样酶 ATG10 转运并结合 ATG5， 然后和 ATG16 结合， 生成ATG12-ATG5-ATG16 的多体复合物。这个复合物定位于前自噬体结构的外膜表面， 并参与前自噬体外膜的扩张。

LC3 在酵母中的同源基因是 ATG8。LC3 的修饰过程同样需要类似泛素活化酶 E1 和 E2 的参与。LC3 前体形成后被 ATG4 加工成胞浆可溶性的 LC3-Ⅰ， 然后在 E1 样酶 ATG7 和 E2样酶 ATG3 的作用下， 和磷脂酰乙醇胺(PE)共价连接成为脂溶性的 LC3-PE（也就是 LC3-II），并参与膜的延伸。LC3-Ⅱ能够与新形成的膜结合， 直到自噬溶酶体(Autolysosome)的形成。因此， LC3-Ⅱ常用作自噬形成的标识物， 也是一种重要的定位于自噬泡膜上的多信号传导调节蛋白。

哺乳动物的 ATG12-ATG5 类泛素化过程和 LC3 类泛素化过程并不是独立运行的， 它们之间可以相互作用、 相互调节。

4） 自噬体的成熟阶段：自噬体的成熟主要是指自噬体通过微管骨架在转运必须内吞体分类复合物(ESCRT)和单体 GTP 酶(Rab S)作用下， 与溶酶体融合形成自噬溶酶体的过程。参与成熟阶段的溶酶体相关蛋白还包括：LAMP1、 LAMP2、 UVRAG(紫外线抵抗相关肿瘤抑制基因)。

5） 自噬体的裂解阶段：是指自噬溶酶体膜的裂解及内容物在溶酶体水解酶的作用下降解的过程。降解过程中产生的氨基酸及部分蛋白可以为细胞提供营养、 能量或循环利用。

5.自噬诱导剂

a) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激

b) Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase 抑制剂（即Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶）

c) Earle's平衡盐溶液：制造饥饿

d) N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制剂

e) Rapamycin：mTOR抑制剂

f) Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂

6.自噬抑制剂

a) 3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制剂

b) Bafilomycin A1：质子泵抑制剂

c) Hydroxychloroquine（羟氯喹）

除了选用上述工具药外，一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预：包括反义RNA干扰技术（Knockdown）、突变株筛选、外源基因导入等。

7.自噬的检测手段

自噬的评估通常采用多个自噬阶段的标志物，因为自噬小体数量的增加可能是自噬上调也可能是自噬_后阶段降解被抑制所致，所以设置合适的对照很有必要。

（1）透射电镜，电镜观察自噬体和溶酶体的超微结构；

（2）WB检测标志物LC3/Atg8和p62/SQSTM1；生化检测自噬体膜标志蛋白， 特别是ATG12、 ATG5 和 LC3；荧光显微镜检测 LC3 或GFP-LC3 斑点的形成；生化检测自噬底物 p62。

（3）WB检测Lamps、Atg5、Atg14和Beclin-1。

（4）组织蛋白酶Cathepsin活力检测。

（5）IF检测自噬潮autophagic flux

自噬过程进行观察和检测 细胞经诱导或抑制后，需对自噬过程进行观察和检测，常用的策略和技术有：

（1）观察自噬体的形成

由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore的特征为：新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。自噬体（AV1）的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体（AV2）的特征为：单层膜，胞浆成分已降解。（autophagic_acuole，AV）

（2）在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成

由于电镜耗时长，不利于监测（Monitoring）自噬形成，人们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。

（3）利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。

（注意：LC3抗体对LC3-II有更高的亲和力，会造成假阳性。需要多种检测方法结合使用，同时需考虑溶酶体活性的影响。）

（4）检测长寿蛋白的批量降解：非特异

（5）MDC（Monodansylcadaverine，单丹磺酰尸胺）染色：包括自噬体，所有酸性液泡都被染色，故属于非特异性的。

（6）CellTrackerTM Green染色：主要用于双染色，但其能染所有的液泡，故也属于非特异性的。

自噬相关蛋白的定位 在研究自噬相关蛋白时，需对其进行定位。

由于自噬体与溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体关系密切，为了区别，常用到一些示踪蛋白在荧光显微镜下来共定位：

Lamp-2：溶酶体膜蛋白，可用于监测自噬体与溶酶体融合。

LysoTrackerTM 探针：有红或蓝色可选，显示所有酸性液泡。

pDsRed2-mito：载体，转染后表达一个融合蛋白（红色荧光蛋白+线粒体基质定位信号），可用来检测线粒体被自噬掉的程度（Mitophagy）。

MitoTraker探针：特异性显示活的线粒体，荧光在经过固定后还能保留。

Hsp60：定位与线粒体基质，细胞死亡时不会被释放。

Calreticulin（钙网织蛋白）：内质网腔

（注意：这些蛋白均为胞浆蛋白，爬片或胰酶消化的细胞在做免疫荧光前需先透膜（permeablize），可采用0.1%SDS处理。）

8.自噬研究常规思路

通常情况下，除了研究自噬现象本身，大家更多的是将自噬与各种生命活动或者疾病结合起来，把自噬作为这些方向的一个机制来研究。比如研究自噬如何参与肿瘤的发生发展、如何参与肿瘤的耐药性与复发转移、如何参与肿瘤免疫治疗的效果、如何参与炎症反应、如何参与氧化应激，如何参与自闭症、阿尔兹海默症的发生与治疗等，通常的研究模式：

（1）证明自噬参与了相关研究表型（电镜、LC3II/I-WB、LC3亚细胞定位、LC3荧光示踪监测自噬流等）

（2）证明自噬在表型中起到关键作用（通过自噬抑制剂、激动剂进行关联研究）找到表型与自噬桥梁分子（检测pI3K通路、Beclin-1、ATG家族各成员）

（3）在基因层面通过gain of/lost of function研究桥梁分子在自噬中的作用。

9.研究自噬的文献参考

[1]. Emerging Mechanisms in Initiating and Terminating Autophagy. Trends Biochem Sci. 2017 Jan;42(1):28-41.

[2]. Targeting autophagy in cancer. Nat Rev Cancer. 2017 Sep;17(9):528-542.

[3]. Autophagy: controlling cell fate in rheumatic diseases. Nat Rev Rheumatol. 2016 Sep;12(9):517-31.

[4]. Crosstalk between autophagy and inflammatory signalling pathways: balancing defence and homeostasis. Nat Rev Immunol. 2016 Nov;16(11):661-675.

[5]. Autophagy and Neurodegeneration: Pathogenic Mechanisms and Therapeutic Opportunities. Neuron. 2017 Mar 8;93(5):1015-1034.

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[7]. Epigenetic Control of Autophagy: Nuclear Events Gain More Attention. Mol Cell.2017 Mar 2;65(5):781-785.

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（2014?武昌区模拟）如图所示的直角三角形ABC是玻璃砖的横截面，∠B=90°，∠A=30°E为BC边的中点，BC=三

解答：解：

（i）作出光路图，光线在AC面上的入射角为60°，折射角为30°，则折射率n=

（ii）作出光束经BC面反射后的光路图，因为发生全反射的临界角为：sinC＝

所以光线在F点发生全反射，在H点不能发生全反射．即该光束经一次反射后，到_次射出玻璃砖发生在H点，

则光线在玻璃砖内传播的时间为：t＝

光线在玻璃砖内传播的速度为：v＝

联立解得：t＝

答：

（i）玻璃砖的折射率为

（ii）该光束从射入玻璃砖开始计时，经BC边上的E点反射后，到_次射出玻璃砖所需的时间为

梦幻模拟战1问答_属性

问题1：_が破灭の危机に陥ったとき、我々を救うものは？51q20

“伟大なる神々”77Qg8

“豊かな知识”eLA8g

“己の力”SghLm 修得魔法：フォースヒール1IdnZ6

修得魔法：サンダーWt2R9

——06vVv →问题2bj0xi

→问题3FPL9S

→问题42SWCf

问题2：暗の者に対して贵方の持つイメージは？Y3Is8

“邪悪なる敌”gTAvQ

“崇拝の対象”OsJEa

“取るに足らない存在”a7zPG 修得魔法：ターンアンデット、MP+29zp7j

获得道具：デビルアックスJWHfS

获得道具：ミラージュローブ、MP+2p_L5 →问题5l7CD1

→问题6vne6l

→问题7sAF4z

问题3：贵方はこの_で、何のために生きていくつもりですか？5I7hP

“爱する人を守るため”yQBQ3

“己を高めるため”B8kst

“梦をかなえるため”vHBQy 修得魔法：プロテクション13j6aD

AT+2、DF+1ON21N

修得魔法：アタック1、MP+4WGoMJ →问题58y8o8

→问题619v8G

→问题7F1gYt

问题4：今、味方の侦察部队が包囲されています。しかし、贵方の部队も危険な状态です。EU2ue

贵方は部队に対してどのように指示しますか？Fffbs

“退却を命じる”OpGHN

“援军を呼び、防戦する”6343X

“侦察部队を助けに行く”4T4jC EXP+7dcuY2

获得道具：ウォーハンマーIt3bQ

获得道具：クロス、修得魔法：ヒール1RwC5M →问题6Lc3B0

→问题7QregK

→问题8p9xEX

问题5：あなたにとって爱とはどのようなものですか？e6Ve4

“与え合うもの”CNKbX

“受けるもの”MW25G

“无限の力の源”R838T 修得魔法：チャーム、MP+17V68q

获得道具：ウォーハンマーfCWl9

AT+16Is6E →问题914634

问题6：あなたがこの_に望むものは何ですか？39RJ3

“爱と希望と勇気”G8G2X

“意のままに生きる自由”4MuKh

“秩序ある_”pmwRt AT+19D4cp

MP+2DSjiZ

DF+17PowD →问题9cacGM

问题7：国を治めるために必要と思われる能力は？BmLnC

“カリスマ”ziaKp

“决断力”ZjEeA

“実行力”DIhL4 修得魔法：チャーム、MP+123oNK

修得魔法：クイック、MP+176t0t

AT修正+1N139v →问题96Xna2

问题8：英雄になるために必要と思うものは何ですか？7L5ad

“不屈の精神”SI1X6

“统率力”HikT9

“勇気” 09UiN 魔法耐性+10Kqk7J

DF修正+1QgGY7

AT修正+1GdL4X →问题9p5Z82

问题9：戦いが始まったとき、あなたが自分に対して求める能力は何ですか？XTlGc

“豊富な戦术知识”vPa16

“冷静な判断力”fyXpZ

“强大な力”Z621n 修得魔法：ヒール1、MP+3、AT修正+1NxgyI

DF+1、MP+2、DF修正+15w7U7

AT+1、、DF+1、AT修正+1、DF修正+1KkIsW →问题105147G

问题10：あなたが理想とする部队はどのようなものですか？AAhmc

“少数精锐”zXwJ6

“个人の力は弱いが大部队”DO34Z

“自分1人で十分”354tM AT修正+1、DF修正+1、佣兵-1GX3l3

佣兵+1MMfrT

AT+2、DF+1Nr19V →问题1181632

问题11：_后に、あなたは何のために戦うのですか？T04z1

“名誉を得るため”0Es55

“祖国を守るため”bFw3a

“爱する人を守るため”g1z6m AT+2JEf63

修得魔法：アタック1、MP+1UL4g7

プロテクション1、DF+1GRH4x 完T

一切为了省钱！这四款SUV百公里不到7升油

而在国内，SUV也有很高的市场热度，它的大空间、高通过性、高视野等无不受消费者喜爱，然而由于SUV比同级的轿车整备质量要更高一些，导致油耗上会更高一些，因此油耗成为消费者关心的话题。今天为大家介绍几款10万左右的SUV，并且工信部给出的百公里综合油耗很低，_居然5.5L。

奔腾T77

指导价：8.98-13.88万

百公里油耗：6.3L

由大量几何线条和棱角元素所组成的前脸，奔腾T77天生就带有几分不怒自威的即视感，加上内凹设计的点阵式镀铬中网，在增强整个前脸立体感的同时，也多了几分_。内饰整体营造出了非常强的科技感，双12.3英寸的液晶连屏带来了很强的视觉冲击，它们的显示精度和操作流畅度都表现得足够令人满意，再加上车机系统出色的功能多样性和可玩性，抓住了时下年轻人的购车需求。

动力方面搭载1.2T四缸发动机，_马力143Ps，峰值扭矩204N·m，百公里综合油耗仅6.3L；1.5T发动机_功率为124kW，_扭矩为258N·m，热效率高达39%，百公里综合油耗低至6.8L，传动系统匹配的是6速手动或7速双离合变速箱。

宝骏RS-3

指导价：7.18-9.88万元

百公里油耗：6.8L

新宝骏在定位上要高于宝骏，在外观上，新车延续了新宝骏"星际几何"的设计理念，时尚动感，但全新配备的运动型前保险杠让车身姿态更显硬朗，力量感满满。同时，新车的轮胎规格加大，配备了17寸双色精车轮毂，凌厉的动感线条，在动与静之间，尽情释放运动_。内饰方面，新车型增加了全黑配色，沉稳大气中凸显神秘感和时尚感。

动力系统是此次升级_显著的变化，全新RS-3车型搭载了新宝骏家族式黄金动力，采用1.5T涡轮增压发动机，实现_功率108kW，_扭矩250N.m的强劲动力表现。搭配模拟8速的CVT无级变速器，除了动力充沛平顺之外，油耗低至6.8L。

雪铁龙C3-XR

指导价:?9.48-11.89万

百公里油耗：5.5L

C3-XR前脸设计饱满有力，在彰显SUV大气的同时带着一丝呆萌。以双人字东风雪铁龙logo为中心，延伸至两侧的V型设计大灯，并将上方的进气格栅改为了分体式设计，非常具有视觉冲击力。车内C3-XR焕然一新，新车内部多处采用了复古红与黑色的撞色搭配，加上随处可见圆角矩形元素与皮革缝线装饰，总体观感上不错，有着法系车_的_风格。

动力方面，本次新C3-XR搭载了190THP?PURETECH（1.2T三缸）小排量涡轮增压发动机与1.6L?CVVT自然吸气发动机两种动力供选择，两款发动机_功率分别为85kW和86kW。而190THPPURETECH涡轮增压发动机更是连续四年获得国际发动机大奖，在1500转时即可爆发190N_扭矩，工信部百公里油耗更是低至5.5L。

斯柯达柯米克

指导价8.99-12.59万元

百公里油耗：5.8L

斯柯达品牌一直由于其超高性价比闻名于世，旗下车型无论是品质还是做工都是满满的德系风味，柯米克作为旗下的小型SUV，其口碑一直名列前茅。外观设计方面，柯米克并没有用到太多复杂的线条勾勒，但简单的线条搭配反而衬托出它简洁干练的形象，这点非常受年轻消费者的喜欢。内饰方面，柯米克透露着很强烈的"大众"风味，中控台的设计和外观一样，都保持了非常简洁的风格，既不会显得激进，也不会落伍。

动力方面，柯米克搭载了一台1.2T和1.5L发动机，1.2T发动机_马力116匹，_扭矩200牛米，与之匹配的是一台7速双离合变速箱，虽然排量小，但动力足够使用，同时综合油耗仅5.8L；而1.5L发动机_马力112匹，_扭矩145牛米，匹配5档手动和6AT变速箱，综合油耗仅6L。

总结：

以上这四款SUV都是比较省油的车型，起码工信部给出的油耗都不高，理论上开着它们比较省钱。但是再省油的车，如果没有一个良好的驾驶习惯与合适的路况，油耗也会不太理想。

本文来源于汽车之家车家号作者，不代表汽车之家的观点立场。

非常高兴能与大家分享这些有关“lc3模拟器”的信息。在今天的讨论中，我希望能帮助大家更全面地了解这个主题。感谢大家的参与和聆听，希望这些信息能对大家有所帮助。